Mozaika genetyczna i kliniczna w rodzaju naskórkowego noworodka czesc 4

Uzupełniany przez PCR komplementarny DNA z kontrolnych keratynocytów wykazywał tylko ATG (Met) w kodonie 150 i CGC (Arg) w kodonie 156. Wszystkie te mutacje znajdowały się w konserwatywnym końcu aminowym segmentu pręta K10. Jedna z tych mutacji, mutacja Met-to-Thr w reszcie aminokwasowej 150, była w tej samej metioninie, która została zastąpiona przez argininę u innego pacjenta z hiperkeratozą nadtwardówkową23. Inną mutację K10, substytucję Cys lub His dla Arg, stwierdzono u co najmniej 12 niespokrewnionych osób z hiperkeratozą nadczynnościową15,16,18,20-23. Wcześniejsze analizy około 200 alleli K10 typu dzikiego wykazały, że mutacje w miejscach Met i Arg nie są odmianami polimorficznymi15,23.
Ryc. 5. Ryc. 5. Obliteracja miejsca restrykcyjnego-endonukleazy w jednym z dwóch alleli K10 u rodziców z naskórkiem i ich potomstwem z hiperkeratozą epidermolityczną. Fragmenty genomowego DNA wytworzone przez trzy różne zestawy starterów, dwa obejmujące mutację Met-to-Thr K10 w kodonie 150 i jedną obejmującą mutację Arg-to-Cys K10 w kodonie 156, amplifikowano i strawiono endonukleazą restrykcyjną NlaIII (panel A i Panel C) lub AciI (panel B i panel D). Mutant oznacza klonowany nieprawidłowy allel z keratynocytów uszkodzonych, a uszkodzenie normalne oznacza klonowany prawidłowy allel ze zmian keratynocytów. Próbki rozdzielano przez elektroforezę przez żele agarozowe, a prążki wizualizowano przez barwienie bromkiem etydyny. Pacjent i tkanka, z których uzyskano DNA, są wskazani powyżej każdego żelu (kontrola pochodzi od osoby bez mutacji). Wskazano również źródło keratynocytów i fibroblastów (z uszkodzonej lub zdrowej skóry). W przypadku pacjenta C-1 badano fibroblasty z uszkodzeń na brzuchu (zmiana 1) i udo (zmiana 2). Wskazane są prążki charakterystyczne dla normalnych i zmutowanych alleli K10. Należy zauważyć, że miejsce rozszczepienia NIIIIII jest tracone w wyniku mutacji Met-to-Thr, a miejsce AciI jest tracone w wyniku mutacji Arg-do-Cys lub Arg-to-His.
Aby dodatkowo zbadać te mutacje, wybraliśmy startery do amplifikacji fragmentu o wielkości 587 bp i fragmentu o wielkości 206 bp, który obejmuje mutację Met-to-Thr w kodonie 150 i mutację Arg-do-Cys lub Arg-to-His w kodon 156, odpowiednio. Endonukleaza restrykcyjna NlaIII tnie fragment 587-bp typu dzikiego, aby wytworzyć fragment o wielkości 443 bp, który można zobaczyć na żelu agarozowym (Figura 5A, fragmenty o 106 pz i 38 pz nie są widoczne). Mutacja u pacjentów A-1 i A-2 eliminuje jedno z tych miejsc cięcia, powodując fragmenty o długości 549 pz i 38 pz (Figura 5A). Endonukleaza restrykcyjna AciI przecina fragment 206-bp typu dzikiego w jednym miejscu, dając fragmenty o długości 89 pz i 117 pz. Mutacja u pacjentów B-1 i B-2 niszczy to miejsce (Figura 5B). Trawienie enzymatyczne DNA PCR od Pacjentów A-2 i B-2 pozostawiło około 50 procent (w ujęciu molowym) odpowiedniego nietkniętego miejsca endonukleazy restrykcyjnej. Odkrycia te są zgodne z obecnością autosomalnej dominującej mutacji, która niszczy miejsce cięcia w jednym z dwóch alleli.
Mutacje K10 w keratynocytach od rodziców
Aby przetestować hipotezę, że naskórkowy znamię typu hiperkeratotycznego epidermolityki powstaje z mutacji postjotycznej w K1 lub K10, wyekstrahowaliśmy RNA z keratynocytów hodowanych z próbek skórnych i niejonowych
[więcej w: test woronowicza, zespół heerfordta, najrzadsze choroby genetyczne ]

Powiązane tematy z artykułem: najrzadsze choroby genetyczne test woronowicza zespół heerfordta