Klony B-komórkowe jako wczesne markery przewlekłej białaczki limfatycznej cd

Wyszkoleni eksperci ds. Danych PLCO dokonali przeglądu i potwierdzili każdy zgłoszony przypadek raka. Wykorzystując istniejące dane z dokumentacji medycznej (w tym dane kliniczne, wyniki badań laboratoryjnych i cytometrii przepływowej oraz raporty z patologii), w tym badaniu przeprowadziliśmy niezależny przegląd wszystkich dostępnych danych klinicznych dotyczących pacjentów z CLL. Badanie przeprowadzono zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez instytucyjną komisję odwoławczą w National Cancer Institute oraz w każdym z 10 ośrodków badań przesiewowych.
Obsługa próbek
Ponieważ standardowe metody separacji limfocytów metodą gradientu Ficolla i kriokonserwacji są niezwykle kosztowne w przypadku dużych badań epidemiologicznych, badacze w badaniu PLCO opracowali i zatwierdzili protokół zbierania plonów 29, obejmujący pobieranie krwi w ogólnokrajowych ośrodkach badań przesiewowych w kwasie cytrynian-dekstroza, a następnie przesyłkę ekspresową. do laboratorium przetwórczego w Frederick, w stanie Maryland, gdzie przeprowadzono pełną krew z 5% dimetylosulfotlenkiem do kriopróbek i stopniem zamrażania o kontrolowanej szybkości, w celu utworzenia próbnego repozytorium limfocytów. Próbki pełnej krwi (1 ml), które przechowywano w zamrażarkach z płynnym azotem, rozmrożono i zastosowano próbkę 500 .l do cytometrii przepływowej sześciokolorowej (z przeciwciałami CD45, CD19, CD5, CD10, kappa i lambda); pozostałe 500 .l pełnej krwi użyto do analizy genu zmiennego łańcucha ciężkiego immunoglobuliny (IGHV).
Cytometrii przepływowej
Dwie 100-.l próbki rozmrożonej krwi umieszczono w dwóch probówkach do barwienia. Zostały one trzykrotnie przemyte za pomocą podkładek Sorvall. Następnie dodano 10 .l króliczej immunoglobuliny i inkubowano w 37 ° C przez 30 minut, a następnie 10 .l koktajlu izotypowego (składającego się z IgG skoniugowanego z izotiocyjanianem fluoresceiny, IgG skoniugowanego z fikoerytryną, sprzężonego z cyjaniną 5-perydynina-chlorofil-białko 5.5 – przeciwciała przeciw-CD19, skoniugowane z fikoerytryną-cyj aniną IgG, sprzężone allofikocyjaniny IgG i przeciwciała anty-CD45 skoniugowane z H7), które dodano do jednej probówki; druga probówka była barwiona specjalnym sprzężonym sześciokolorowym koktajlem przeciwciał (składającym się ze sprzężonego z izotiocyjanianem anty-CD5, sprzężonego z fikoerytryną anty-lambda, sprzężonego z perydyniną-chlorofilem-cyjaniny 5,5 przeciwciała anty-CD19, fikoerytryny-cyjaniny 7 Skoniugowane CD10, skoniugowane z allofikocyjaniną przeciwciała anty-kappa i alloglikocyjaniny H7 anty-CD45) i inkubowane przez 20 minut. Wszystkie przeciwciała uzyskano z BD Biosciences. Po tej procedurze do każdej probówki dodano ml buforu do lizy z czerwonych krwinek i inkubowano przez 10 minut, a następnie przemywano myjką komórek Sorvall. Komórki następnie ponownie zawieszono w 350 .l soli fizjologicznej buforowanej fosforanem i uzyskano przy użyciu cytometrii przepływowej FACSCanto; codzienną kontrolę jakości i zapewnienie przeprowadzono przy użyciu koralików o siedmiu kolorach (BD Biosciences).
Analiza IGHV
Całkowity RNA został ręcznie wyekstrahowany z pełnej krwi przy użyciu RNA-BEE (Tel Test) i oczyszczony za pomocą kulek magnetycznych Dynal (Invitrogen) w celu otrzymania informacyjnego RNA (mRNA). Oczyszczony mRNA amplifikowano za pomocą 6-sensownych primerów wiodących dla rodziny IGHV (HV1-HV6) i antysensownego startera w regionie łańcucha . w jednej multipleksowej jednoetapowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkryptazą (RT -PCR).
Klonowany produkt, jeśli był obecny, wycięto z żelu, oczyszczono metodą ekstrakcji z żelu MinElute (Qiagen) i zsekwencjonowano starterem łańcucha ciężkiego z użyciem BigDye Terminator, wersja 3.1, na analizatorze genetycznym ABI 3730 (Applied Biosystems)
[hasła pokrewne: dda ddd, legowisko dla psa allegro, koncentracja życia wokół picia przykłady ]

Powiązane tematy z artykułem: dda ddd koncentracja życia wokół picia przykłady legowisko dla psa allegro